Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

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Cromatografía de Líquida de Alta Eficiencia

(High Performance Liquid Chromatography)

Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

* Tipos de Cromatografía Líquida
o

Cromatografía de Partición.
*

Cromatografía de Adsorción
*

Cromatografía Iónica
* Cromatografía de Exclusión

Diagrama Básico de un sistema de HPLC

* Eleccción del Solvente

Características:
o

Disponible comercialmente
*

Precio
*

Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impuresas.
*

Disolver la muestra
*

Misible con otros solventes para formar mezclas útiles
*

No degradar o disolver la fase estacionaria
*

Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
* Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)Filtración y Desgasificación de solventes
o
+
#

Filtro a la Entrada del Solvente

Métodos de Filtración de Solventes en HPLC

Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC :

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Técnicas del Laborario Moderno más importantes como herramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos. Como en todas las técnicas analíticas, los pequeños problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolución de los cromatografos líquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que ésta no puede resolver.

Hasta los Solventes para HPLC, tods filtrados cuidadosamente en la fábrica, pueden acumular partículas en suspención que pueden ser perjudical a los componentes del sistema HPLC. Estas partículas en suspención pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposición al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depósito para solvente, la exposición a partículates del aire durante el almacenamiento del solvente en el depósito del solvente, la degradación lenta del recipiente solvente, o de condensación y polimerización del solvente. Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmósfera. El trasegado del solvente en el depósito solvente y su almacenamiento en estos depósitos máseste fenómeno. El Oxígeno Disuelto que constituye el 21% de la atmósfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.
*

Filtración al Vacío
* Filtración en Línea
Sonificación

Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

Existen cuatro(4) métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:
*

Burbujear Helio
*

Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
* Desgasificación al Vacío en LíneaBombas

Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo:
o

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
*

Mantener el flujo libre de pulsaciones
*

Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
*

Control y reproducibilidad del flujo de solvente
* Componentes de la bomba resistentes a la corrosiónLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:
o

Mecánicas
+

Recíprocantes
*

De desplazamiento contínuo
o Neumáticas

Programación del Solvente

Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:
o Isocrático

*
o

Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
+

A baja presión
* A alta presión
o
+

Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible.

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos objetivos:
* Asegurar alta presición y exactitud.
o
+

Determinar la composición inicial y final del solvente

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasos fundamentales:
*

Ajustar el tiempo del gradiente
*

Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
*

Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusión
* Regresar a las condiciones iniciales la columna.Sistemas de Inyección de muestra

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vávulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias

Tipos de Columna:
Fuentes de daño de una columna de HPLC:

* Obstrucción por partículas pequeñas en los solventes o fases móviles
* Obstrucción por materiales no eluídos en las muestras
* Variación de las características de retención por incremento de materiales no eluídos

Detección

La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del efluente, así como también de lascaracterísticas de las señal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
o

Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refracción
* Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector UltravioletaLos detectores más utillizados en HPLC son:
o

Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
+

Detector de Longitud de Onda Fija
*

Detector de Longitud de Onda Variable
*

Detector de Arreglo de Diodos
o

Detector de Indice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:
+

Tipo Deflexión
*

Tipo Fresnel
o

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización .
*

Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
o
+

Según la Fuente de Excitanción
*

Según el sistema óptico
o

Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
+

Detector Amperométrico
*

Detector Conductimétrico
*

Detector Potenciométrico

Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroquímicos para asegurarse análisis reproducicbles:
o
+
#

Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador (integrador.
*

Usar bombas reciprocantes de doble piston
*

Mantener en todo momento el flujo de la fase móvil en el detector.
*

Operar con el voltaje adecuado
*

Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos.
*

Tener electrodos de referencias extras en solución 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 ó 2 veces a la semana.
*

Desconectar el detector electroquímico cuando este llimpiando las columnas.
* Utilizar agua, buffers y solventes orgánicos de alta pureza.Derivatización

Existen dos tendencias :
o

Pre-Columna
* PostColumnaAnalisis Cualitativo y Cuantitativo

Problemas más comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas posibles, y cómo solucionarlos.
o

Presión Alta
+

Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas.
*

Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si ésto no funciona reemplaze el fritado a la entrada de la columna. Si la presión sigue alta reemplaze la columna.
*

Solución a largo plazo: Asegurese que todas las fases móviles se filtren apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
o

Pérdida de la Resolución
+

Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas.
*

Solución: vea la sección de Presión Alta
*

Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.
o

Picos Hendidos
+

Posible causa : Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas.
*

Solución: Marcha atrás columna roja con presión baja está al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna.
*

Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC.
o

Variación en los Tiempos de Retención
+

Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil.
*

Solución: Bomba primera y está fases seguras tan móviles es propiamente [degassed]
*

Solución a larga plazo: Asegurese fase tan móvil está propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en línea asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing] completo.
o

Variaciones de la Línea Base
+

Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los solventes de la fase móvil.
*

Solución: Asegurese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector.
o

Línea Base con mucho Ruido
+

Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
*

Solución: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase movil del sistema.
o

Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)
+

Posible causa: Oxígeno Disuelto
*

Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto.
*

Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto.
o

Baja ó Ninguna Presión
+

Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas en suspención en la fase móvil.
* Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC

Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus necesidades:
o

Cuántas muestras y tipos de ensayos
*

La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento)
*

La exactitudad y presición del sistema de bombas
*

El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
*

Que tipo de servicio ofrecen ó puede ofrece la casa vendedora
*

Suministro de software y compatibilidades
* Cuánto puede PAGAR usted !

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107 comentarios en “Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

    Nperilla escribió:
    4 marzo, 2008 en 21:51

    Hola Juan,
    Te queria hacer una pregunta. Actualmente estoy en un taller analizando Cafeina y Acido benzoico en cafe y bebidas colas.
    El analisis se hace por HPLC en fase reversa con una fase movil de Acetonitrilo:agua:acido acetico.
    Mis preguntas son dos:
    1. Para que sirve el acido acetico, tiene que ver con la ionizacion de los compuestos? (pKa
    cafeina 10.4 y Acido benzoico 4.2)
    2. La metodologia esta modificada de una anterior en donde solo usan agua acido acetico, entonces, que proposito tuvo el incluir acetonitrilo en esta nueva fase movil?

    Ojala me puedas ayudar. espero oir de ti.
    Un saludo,

    JUAN CARLOS escribió:
    3 abril, 2008 en 21:58

    bueno soy estudiante de la Rafael Landivar de Guatemala y curso un tecnico en investigación criminal y forense esta información me es muy util si existiera un poquito más se los agradecere

    Maritza escribió:
    8 mayo, 2008 en 14:29

    Hola
    Estoy trabajando con HPLC-Fluorescencia en hidrocarburos aromaticos policiclicos con solvente CH3CN/agua, y la linea base se fue subiendo desde 6 hasta 10 y ahora no baja, y esto no permite ver los picos pequeños en el cromatograma. Tu que me sugieres?

    Muchisimas Gracias,

    Marisa Rodriguez escribió:
    27 agosto, 2008 en 18:34

    hola necesito ver si podrian ayudarme
    como puedo preparar una solucion:
    Tris 400 milimolar MgCl2 10miliMolar
    aartir de Tris 1M y MgCl2 1M

    se los agradeceria mucho, porfavor si podrian mandarme lo a mi correo se los agradesco.
    marisa

    erica escribió:
    7 octubre, 2008 en 17:56

    hola lo mio es muy basico no se leer el espectro.me podras ayudar?

    Melvin escribió:
    9 octubre, 2008 en 3:27

    Hoa necesito ayuda en la interpretacion de los cromatogramas y como elabaorar una secuencia en el HPLC

    natrilix78 escribió:
    11 octubre, 2008 en 16:41

    hola, erica… lo primero que debes saber es que si estamos hablando de cromatografia los datos que obtienes de los equipos no debes llamarlos espectros sino cromatogramas.. en cuanto a tu pregunta, debes saber que cada compuesto que eluye de la columna lo hace a un tiempo de retencion determinado, el cual depende de la columna que estes usando, por lo que te recomiendo siempre usar un patron para que puedas comparar tu muestra. O, emplear un HPLC acoplado a masas que te pueda identificar que compuestos presentes en tu muestra, ojo aqui si estariamos hablando de espectros de masas… para lo cual te recomendaria asesoria pues no es sencillo elucidar uno… espero haberte ayudado…

    rodrigo pradenas escribió:
    13 octubre, 2008 en 20:19

    Muy buena la referencia que hacen a los posibles problemas en HPLC, yo trabajé en mi tesis con HPLC con detecdtor de fluorescencia para analisis de OTA en vinos chilenos, y me parece interesante que se encuentren páginas en la red con informacion importante para los usuarios.

    rosa escribió:
    18 enero, 2009 en 5:57

    Hola, necesito saber como interpretar un cromatograma y como expresar los resultados obtenidos de la curva estandar y de la muestra analizada, que es vitamina C.

    Menvile escribió:
    19 enero, 2009 en 3:47

    Hola necesito saber sobre cromatografia de azucares en especial de la ribosa. Gracias

    jannette escribió:
    12 marzo, 2009 en 3:59

    esta pagina es muy buena y muy interesante, soy del D.F y actualmente estoy estudiando mi servicio social para obtener mi licenciatura en baja california sur, la paz, en el CIBNOR, y estoy aprendiendo sobre la cromatografia en HPLC para pigmentos y toxinas es la primera vez que lo hago y es una experiencia muy agradable, y el tema que explican aki es entendible y didactico, sigan asi.

    jannette escribió:
    12 marzo, 2009 en 4:02

    ah! se me olvidaba, me gustaria saber que es la cromatografia integral. gracias

    Veronica Jimenez Hernandez escribió:
    18 marzo, 2009 en 18:51

    Buenas tardes!

    Me podria sugerir cuales son los solventes que necesito para analizar hidrocarburos, especificamente Diesel y podria enviarme una cotizacion. Espero respuesta.

    Gracias!!

    nicole ayala escribió:
    25 marzo, 2009 en 22:52

    nesecito un practico para hplc

    nicole ayala escribió:
    25 marzo, 2009 en 22:53

    necesito un parctico para hplc

    ALMA DELIA escribió:
    30 marzo, 2009 en 16:41

    HOLA QUISIERA SABER CUAL ES LA DIFERENCIA ENTRE UNA PRECOLUMNA, POSTCOLUMNA Y UNA COLUMNA NORMAL PARA HPLC

    veronica escribió:
    24 abril, 2009 en 10:21

    Hola. Estoy haciendo un estudio sobre toxinas PSP mediante HPLC y necesito saber que fases moviles debo usar para toxinas GTX

    manuquinngarci@gmail.com escribió:
    24 abril, 2009 en 10:26

    Hola , alguien sabe ¿por qué se usa patrones estándar para realizar un cromatograma y luego con RP-HPLC, para las muestras a analizar?; que es patrón estandar? .

    QUIMI escribió:
    10 mayo, 2009 en 14:09

    Hola,
    Si se realiza un HPLC para separar aspirina y cafeina. ¿Cuál tendrá menor tiempo de retención y por qué?
    ¿Habría que utilizar un eluyente polar?

    kurtney escribió:
    7 junio, 2009 en 5:33

    hola, me podrian decir ke solventes utilizar para analizar fructosa , estoy separando las propiedades de un zumo dietetico… de antemano gracia y spero me ayuden.

      PAM escribió:
      23 julio, 2009 en 18:54

      para analizar azucares debes tner un detector IR ( indice de refraccion) y una columna polyamida, la FM es agua acetonitrilo el % de composion puede ser 25:75, y la misma fase movil la puedes ocupar para diluir.

        Alejo Skid Row escribió:
        25 agosto, 2011 en 14:44

        Que fase estacionaria puede usarse para este mismo estudio de azucares ?

    juan escribió:
    18 junio, 2009 en 18:50

    estoy trabajando para detectar cumafos en mieles por hplc con detector UV porque es lo unico que tenemos. Necesito que te fijes si voy bien porque me esta costando bastante y GC no van a comprar. Uso long de onda de 315 nm, FM agua.metanol:acetonitrilo 65:14:21, flujo de 0.5 ml/min y temperatura ambiente. Si hay algo de esto que me quisieran corregir o indicar alguna ayuda se los agradezco

    PAMELA escribió:
    25 junio, 2009 en 1:07

    HOLA ME PUEDES AYUDAR CON EL METODO DE EXTRACCION DE VITAMINA C EN YOGURT GRACIAS

      Josue DF escribió:
      11 julio, 2009 en 12:58

      Prueba una fase normal, yo he encontrado demasiados inconvenientes en la cuantificacion del ascorbico por HPLC-DAD ya que esta vitamina hidrosoluble se degrada muy rapidamente, de hecho he optado por cuantificarla al espectrofotometro

      PAM escribió:
      23 julio, 2009 en 18:50

      para estabilizar la muestra y que la degradacion de la vitamina C sea mas lenta puedes utilizar acido metafosforico 0.1% en solucion para diluir la muestra u/o estandar

    Diego escribió:
    26 junio, 2009 en 14:20

    Hola,
    Trabajo con HPLC y tengo el siguiente problema: Se devuelve la Fase móvil por el agujero del inyector. He limpiado el equipo y he cambiado la columna, pero el problema sigue.
    ¡Qué puedo hacer?

      Josue DF escribió:
      11 julio, 2009 en 12:55

      Posiblemente estes conectando mal la columna, si tienes un compartimento de columna con valvula de switcheo, asegurate de conectar la columna en donde corresponde, si sigue el problema, la tuberia que va de la columna al puerto de inyeccion podria estar dañada y eso provocar la fuga, solo es cuestion de cambiarla

      GERMAN escribió:
      23 agosto, 2009 en 16:02

      Hay dos posibles causas la mas probable es que tienes que cambiar el sello donde se inyecta es una tubito plástico y tambien tienes que cambiar el sello del rotor del inyector, este se cambia anualmete, esto soluciona tu problema

      Roberto escribió:
      20 diciembre, 2009 en 1:40

      Saludos.
      Su problema lo debe de revisar en la bomba,al no existir presión para mandar el liquido este se regresa…

      Att.,
      Dr. Roberto Naranjo
      Químico-Farmacéutico
      qfrobert_carlos@hotmail.com

      ulises escribió:
      1 septiembre, 2011 en 11:23

      1.-lo primero es el tipo de inyector tienes.
      manual automatico.
      2.- que marca y modelo.
      3.- sabiendo esto te puedo ayudar.

    David Insuasty escribió:
    31 julio, 2009 en 16:44

    Hola, trabajo en la supervisión a la calidad de plaguicidas químicos en formulaciones, quisiera saber si alguien conoce un método para la determinación de Mancozeb por HPLC?. Gracias

      taz escribió:
      24 mayo, 2011 en 3:26

      EPA 0630

      taz escribió:
      24 mayo, 2011 en 3:29

      pero no es HPLC, pero tal vez te sirva

    Zecarlos escribió:
    8 octubre, 2009 en 18:25

    1) Cual es la diferencia entre na columna y un cartucho en HPLC
    2) que son las columnas monoliticas o de que se diferencian en las otras, ejemplos

    Milton Lopez escribió:
    14 diciembre, 2009 en 20:31

    necesito aprender a manejar un HPLC, y diferentes tecnicas para la separacion de mezclas, identificacion de productos ,determinacion de plaguicidas , alcaloides y muchas otras determinaciones. que puedan servirme a tener un empleo y ayudar en mi comunidad.

    Milton Lopez escribió:
    14 diciembre, 2009 en 20:34

    me gustaria aprender a manejar un HPLC, y conocer tecnicas de analisis en la determinacion de una serie mezclas de quimicos asi como determinar barbituricos alcaloides pesticidas entre otras sustancias, que me permitan conseguir un empleo. Gracias por todo el material de informacion que tienen sigan instruyendo .

    ana clara escribió:
    2 enero, 2010 en 15:58

    me gustaria saber si me podrian decir como se prepara uin nlitro de la fase movil del sistema isocratico 57% de acetonitrilo 41% de agua 2% de acido acetico…desde ya muchas gracias

      Alejandra escribió:
      2 junio, 2011 en 14:35

      Sencillo, mide 570 mL de Acetonitrilo, 410 mL de agua y 20 mL de acido acetico.

    Andrea escribió:
    25 enero, 2010 en 11:27

    Hola!tengo una duda urgente, q mañana tengo el examen de practicas…cual es la funciónde acido acetico en la determinacion de cafeina por HPLC?Supongo que es algo de los grupos ionizables de la cafeína pero no lo tengo. ¿Se supone que esta cargada la cafeína cuando se separa? (fase estacionaria C18)
    A ver si me puedes contestar(por favor, al mail)

    andrea escribió:
    7 febrero, 2010 en 20:53

    hola
    oye una pregunta, estoy trabajando con muestras de orina, para la cuantificacionde acetil isoniciada e isonicida,pero el problema es que tengo mucho ruido en los primeros 3 mins. de la corrida y se enpalma con el farmaco, quisiera saber si puedes darme una idea de con que puedo quitarle el ruido a la muestra,pues el ruido puede ser de hasta 200 mVolts y necesitoq ue se redusca a 16mVolts, te lo agradeceria mucho
    de antemano gracias.

    carmen escribió:
    11 febrero, 2010 en 3:07

    hola me podran ayudar,tengo propbleas con valoracion de la rifampicina, sera que em podran enviar un cromatograma de rifsmpicina para guiarme

    Anabela escribió:
    26 febrero, 2010 en 17:00

    Hola
    Muy buena la página, quisiera saber si alguien de ustedes tiene conocimiento de cómo analizar lactosa en muestras de leche con un detector de infrarrojo, mi inquietud es más sobre còmo tratar la muestra para separar las proteìnasu poder analizar solo azúcares.
    Saludos

      PACHE escribió:
      16 junio, 2011 en 18:10

      Sin duda el manejo del HPLC es sencillo y hasta metodico lo realmente interesante es la preparacion de la muestra.

      Mira supongo que ya es muy tarde para contestar tu pregunta seguramente ya lo has resuelto si es asi por favor cuentanos que hiciste.

      A mi se me ocurre hacer una hidrolisis acida (puede ser acido clorhidrico) para hidrolizar las proteinas mas aun si añades temperatura para desnaturalizar las proteinas (en terminos vulgares seria cortar la leche, jiji). Obviamente estas precipitarian y tendrias que filtrar y tratar el sobrenadante.

      Se me ocurren mas cosas si aun no resulves el problema, escribeme a eclipsed22000@yahoo.com.mx

      saludines

    jorge escribió:
    1 marzo, 2010 en 15:56

    Sabe alguien un metodo para determinacion de nitroxinil por HPLC, ya sea por UV o Fluorescencia?

    Esther escribió:
    29 julio, 2010 en 14:09

    Hola,
    alguién sabe de algún laboratorio que preste servicios para determinar monosacáridos mediante HPLC?
    De preferencia ubicado en: Toluca o D.F.

    Muchas Gracias!

    camila r escribió:
    21 septiembre, 2010 en 22:44

    tengo una duda, cuando se utilizan acetona, agua o metanol es en que fase, normal o reversa u otra??

    responder, gracias

      PACHE escribió:
      12 octubre, 2010 en 19:05

      Reversa, en la reversa los disolventes son polares (ej. agua) en la normal apolares (ej. hexano)

    Barbara escribió:
    8 octubre, 2010 en 16:40

    La consulta es la siguiente: hace dos dias analise una muestra y el pico salia perfecto, sin defecto y cumplia el tailing. Hoy volvi a correr la misma muestra pero el pico sale como con una panza, me parece raro porque mantengo el mismo tiempo de retencion y practicamente la misma area. No se donde puede estar el problema. Como lo puedo solucionar? muchas gracias!

      PACHE escribió:
      12 octubre, 2010 en 19:01

      Si ninguna de tus condiciones cambiaron, debe ser la columna o la fase movil, la columna lavala bien hasta que pase linea base y las fases filtradas y desgacificadas, sino mejor puede ser tiempo de 1) regenerar la columna o 2) cambiarla a flujo inverso o ya de plano cambiarla.
      Saludos espero que te sirva mi respuesta, si quieres escribeme a eclipsed22000@yahoo.com.mx

    PACHE escribió:
    12 octubre, 2010 en 19:04

    Mi pregunta es: baje y sonique todos las valvulas check y tuberias de una bomba LC-20AT funciono perfecto porque de no tener flujo ya lo tengo, el detalle es que quedo con mucho ruido aprox 5 a 10 bars, mi presion no estabiliza sino varia bastante comparando con antes de lavar todo, que hago? ojala alguien me pueda ayudar.
    eclipse d2 2000 arobix yaho comer mex

    Barbara escribió:
    21 octubre, 2010 en 17:50

    Gracias por la respuesta. AHora me pasa con otra columna que se me deforma el pico y la presion esta horrible con la Fase Movil. Le pase agua para limpiar y se estabiliza bien la presion. Cuando vuelvo a pasar FM sucede lo mismo, se vuelve horrible la presion.Como puedo solucionarlo?

    Erica escribió:
    9 noviembre, 2010 en 20:42

    Hola Juan mi situaciòn es la siguiente:
    Como podemos programar al software de HPLC un gradiente lineal con duraciòn de 60 minutos comformado por dos eluentes A y B en donde al A va de 100% a 0% y B de 0 a 100%.Espero tu respuesta
    Saludos
    Erica

      PACHE escribió:
      16 junio, 2011 en 18:04

      eso depende que que sofware este hablando generalmente tienen una tabla que debes poner tiempo y concentracion de A y B.

    Francisca escribió:
    25 enero, 2011 en 19:11

    Mi pregunta es:

    cuál es el porcentaje de eficiencia mínimo que debo tener para poder usar una columna cromatográfica de HPLC

    por favor responderme, gracias.

    ERIKA NAJERA escribió:
    12 febrero, 2011 en 15:15

    Hola me parece interesante descubrir que a mucha gente le apasiona el tema de al cromatografia como a mi. Saludos a todos

    Felix Falconi escribió:
    17 febrero, 2011 en 11:09

    Hola, a quien pueda ayudarme, me gustaria saber lo relacionado a la deteccion de principios activos con el HPLC. Ademas sobre que solventes debo usar. agregar todo lo necesario. les agradezco mucho

    PATRICIA escribió:
    2 marzo, 2011 en 12:18

    Hola ,estoy trabjando con Hplc para la determinación de PAH n aguas. En el cromatograma desde hace unos días la línea base baja bruscamente al llegar a los 15 minutos del tiempo de análisis. No se por qué se produce esto y por qué no se producía en los primeros cromatogramas. Alguien me puede ayudar por favor?.

    Gracias.

    Alba escribió:
    9 marzo, 2011 en 16:19

    Hola, a ver si me puede ayudar alguien… estoy trabajando con HPLC para la detección de nucleótidos. El caso es que manejo cantidades muy pequeñas. Y últimamente me pasa que el tiempo de retención de los standard no me coincide con el tr de mis muestras cuando las enriquezco… ¿por qué pude ser? ¿alguien sabe qué sucede y si se puede solucionar?
    Gracias

    Laura escribió:
    9 marzo, 2011 en 19:15

    Hola!
    Necesito ayuda para saber como interpretar un cromatograma y como expresar los resultados obtenidos de la curva estandar y de la muestra analizada, que es 5-fluorouracilo. Hay una incógnita en la ecuación de la recta que no sé que es (e).
    Muchas gracias!!
    Un saludo!

      PACHE escribió:
      1 julio, 2011 en 17:32

      Interpolacion y=mx+b m y b las sacas matematicamente ya sabes m es la pendiente de la curva y b es el intercepto que por cierto siempre debe ser diferente a cero.
      Asi y y es la absorbancia y x la concentracion.
      Lo haces hasta en la calcu o en excel

    OSCAR escribió:
    7 abril, 2011 en 17:26

    Necesito analizar acido propionico por HPLC u otra metodologia en un produto liquido.

    Alberto Fariñas bermúdez escribió:
    15 abril, 2011 en 15:49

    Hola: Por favor necesito conocer quién oferta patrones de ESTEVIOSIDOS y REBAUDIOSIDOS para cromatografía HPLC.
    Muchas Gracias
    Alberto

      PACHE escribió:
      1 julio, 2011 en 16:00

      Prueba en Chromadex, Sigma aldich

        Alberto Fariñas bermúdez escribió:
        8 julio, 2011 en 13:28

        Gracias PACHE consultaré Chromadex, Sigma aldich.
        Alberto

    Lorena escribió:
    17 mayo, 2011 en 22:25

    Hola, por favor alguien que me ayude con una técnica para Azúcares y lactosa por detector Uv-vis. Le agradeceria mucho es mega urgente.

    jhanet yovana diaz velasquez escribió:
    26 mayo, 2011 en 15:48

    interesante que hay un sitio como este para entablar conversaciones sobre HPLC

    PACHE escribió:
    15 junio, 2011 en 20:26

    Por unos lados veo que es correcto lavar el HPLC con HCl 0.1% pero otros dicen que no, lo cierto es que necesito lavarlo sobre todo las tuberias de las FM si alguien tiene una buena propuesta por fa escribir a
    eclipsed22000@yahoo.com.mx

    jonathan escribió:
    16 junio, 2011 en 17:57

    pero en que consiste el detector de indice de refraccion tipo fresnel porque aca solo esta mencionado pero no indican su funcion sus ventajas y desventajas

    jonathan escribió:
    16 junio, 2011 en 17:58

    y tambein seria bueno que me explicaran tambien las mismas caracteris ticas par el detector de indice de refraccion tipo deflexion

    PACHE escribió:
    1 julio, 2011 en 17:32

    Olvidenlo ya lo lave

    Maria Jose Cetina Diaz escribió:
    15 julio, 2011 en 16:49

    Hola, trabajo en la supervisión de calidad de la miel, quisiera saber si alguien conoce un método para la determinación de antibioticos como estreptomicina y sulfonamidas por HPLC?. Le agradezco su ayuda. Me urge!!!!!

      PACHE escribió:
      25 agosto, 2011 en 16:33

      UV 340nm columna Lichropher C18 (25 cm x 4.6 mm y 5 µm), FM ácido oxálico 0.13%:acetonitrilo: metanol (60:30:10 v/v/v), flujo fue 1.0 mL/min. Pruebalo y me cuentas, pero me cuentas he siempre dejo respuestas y nadie comparte.

    Sam escribió:
    15 septiembre, 2011 en 13:34

    alguien sabe k tipo de columna utilizar para determinar vitaminas A, B y C y bajo k condiciones.

    PACHE escribió:
    15 septiembre, 2011 en 14:12

    Que tipo de detector?
    Puedes usar una GRACE o ZOrbax SB de 15 cm FM hexanosulfonato de sodio-HAC-MeOH
    a 270nm y checa cual de las el complejo B porque son un chorro.
    Saludos

    Brisseth Chulla Canahuire escribió:
    17 septiembre, 2011 en 23:48

    QUE PASA SI LUEGO DE UNA CORRIDA,olvido poner lavado…….se malogra el equipo o mi muestra

      René escribió:
      31 octubre, 2011 en 18:57

      No se malogra, lo que puede pasar es que puedas deteriorar la silica de la columna, si utilizar una fase movil con par ionico podria ocurrir obstruccion de tu columna. Esta no puede quedar detenida por mucho tiempo, un experto me dijo que es mejor dejarla a flujo pequeño de 0.1mL. Es muy importante el lavado y lavar mejor antes que pase un dia sin que este lavada tu columna.

    Brisseth Chulla Canahuire escribió:
    18 septiembre, 2011 en 1:44

    es necesario programar el equipo para q lave la columna luego de una corrida? que sucede si termina la corrida y no se programa el lavado??

      PACHE escribió:
      19 septiembre, 2011 en 17:53

      Es importante lavar las columnas despues de su uso pues la muestra puede interaccionar con la base de la columna y taparla o alterarla quimicamente, pero no tiene que ser tan “estricto” yo he dejado una columna por la tarde ya la lavo al siguente día temprano.
      Tambien ahi una bombas de lavado de columna que puedes dejar toda la noche a flujo bajos (0.2mL/min) y recuerda cada columna se lava y almacena diferente ;) suerte ojala comentes o juro que dejare este foro :(

    VIVI escribió:
    21 septiembre, 2011 en 13:54

    HOLA ME GUSTARIA SABER POR QUE EN ALGUNAS PRUEBAS POR HPLC DEBO USAR UNA UNIÓN VOLUMEN MUERTO, CUAL ES LA GRACIA DE ESTO.OJALA ME PUEDAS AYUDAR. SALUDOS

      René escribió:
      31 octubre, 2011 en 19:06

      Te comento mi experiencia. Yo solo utilizo volumen muerto cuando quiero limpiar todo el sistema HPLC, pero si mi método me pide analizar impurezas o me pide calculo de señal ruido lo hago obligatoriamente para eliminar cualquier aparicion de picos fantasma en mi cromatograma, ya que generalmente los picos a determinar son pequeños como 5 mAU o 1 de altura. Es por ello que me piden ademas calculo señal ruido.

      Erik escribió:
      15 octubre, 2012 en 18:28

      Las uniones de volumen son solo eso, uniones, se utilizan generalmente para técnicas que utilizan 2 columnas en serie (ya que no se cuenta con una sola lo suficientemente larga), o una pre-columna, la razón es para unirlas sin incrementar la difusión de la muestra durante el pasaje de la muestra de una columna a otra.

    PACHE escribió:
    21 septiembre, 2011 en 14:21

    ojala comenten o juro que dejare este foro

      Suicidal Thoughts respondido:
      28 octubre, 2011 en 23:05

      Comenten o mato al conejo.

        PACHE escribió:
        29 octubre, 2011 en 17:42

        Jajaja que alegria ver a alguien en este foro en extinción, saludos y pues si matemos al conejo

      Suicidal Thoughts respondido:
      29 octubre, 2011 en 19:53

      Eh, no está en extinción, es sólo que no tengo tiempo de responder a todos.

        PACHE escribió:
        29 octubre, 2011 en 21:56

        :O en HPLC responder?? no eso es imposible checa y nadie responde siempre yo y ni las gracias dan

      Suicidal Thoughts respondido:
      29 octubre, 2011 en 22:08

      Gracias.

        PACHE escribió:
        29 octubre, 2011 en 23:01

        Jajaja de nada ;) oye ya que andamos en el tema, la verdad es q lo mio es el HPLC use UV hace mucho tiempo, tu abras hecho pruebas antioxidantes por UV? me ayudas con unos cálculos de FRAP, gracias.

      Erik escribió:
      15 octubre, 2012 en 18:39

      Las columnas debén lavarse siempre con agua90:metanol10 (o solo con agua), pero si no van a utilizarse durante un largo período deben guardarse (lavarse) con una mezcla de agua/solvente utilizada en la técnica a fin de evitar crecimiento bacteriano, secado de la silica (silenoles), eliminar impurezas no eliminadas con el simple paso de la fase móvil, evitar la precipitación de sales existentes en la fase móvil, etc.
      Ej. Agua25:metanol75 (si la fase orgánica de la muestra tiene metanol)
      Agua50:Acetonitrilo50 (si la fase orgánica de la muestra tiene Acetonitrilo)
      Sc Cloruro de sodio 90mM 90%:Metanol 10% (generalmente para columnas de exclusión molecular)

        Lorena escribió:
        18 octubre, 2012 en 15:07

        Pache yo te escribi a tu mail, acerca del perfil de acidos grasos y nunca recibi respuesta.

    victoria escribió:
    4 diciembre, 2011 en 18:43

    estamos haciendo pruebas con ibuprofeno ergotamina y cafeina, HPLC detector uV, alguna idea de condiciones y columnas (l7 o L1) para determinar los 3 activos con la misma tecnica? juro q te estare muy agradecida

      Erik escribió:
      15 octubre, 2012 en 18:43

      Probá con una L7 x 30 cm, luego un flujo de 1ml/min, programá cambios de long. de onda durante la corrida adecuados a cada compuesto. En USP hay para ergotamina y cafeina tablets, pero no hay asociación con Ibuprofeno; te recomiendo un mix de ambas técnicas.

    Patricia Martinez escribió:
    4 enero, 2012 en 16:46

    1. Aspectos fisiologicos (absorción, distribución, metabolización y eliminación) de Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

    2.Incompatibilidad farmacologica Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

    3.Incompatibilidades físicas y químicas Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

    4. Morfologia de Cianocobalamina, Clorhidrato de Piridoxina, MOnonitrato de Tiamina y Riboflavina.

      anonimo escribió:
      4 enero, 2012 en 17:14

      jjajaja eso que??

    Wilmer escribió:
    4 febrero, 2012 en 21:13

    Saludos.
    me pareció muy interesante ésta página, recien estoy realizando mis primeros pasos en cromatografía, estoy acutalmente trabajando con glifosato, me podrían ayudar?

    Fulerita escribió:
    6 febrero, 2012 en 10:22

    ¿Es cierto que al agua de HPLC le salen ongos si no se utiliza por un tiempo?

      Fulerita escribió:
      6 febrero, 2012 en 10:23

      Hongos*

      abbeto escribió:
      12 marzo, 2012 en 12:36

      no solo le salen hongo, también se acumulan partículas que te pueden taponar tanto las tuberías y las columnas. no uses por más de 24 horas, la misma agua.

    Patricia Feito escribió:
    14 marzo, 2012 en 17:32

    Hola!
    tengo una duda que me gustaría que me resolvieras, tengo que hacer una determinación de paracetamol y cafeína en orina por HPLC-UV y me gustaría saber si tengo que hacerle algún tipo de tratamiento especial antes a la orina.
    Muchas gracias.

      Torres V escribió:
      19 marzo, 2012 en 22:05

      Yo considero que por el tipo de muestra que se trata (biológico) debes de centrifugar para separar los sólidos de la muestra y ahora sí preparar la muestra ó en su defecto filtrarla para que el resto de los componentes de la orina no interfieran en la determinación que pretendes realizar, gracias, si encuentras alguna otra alternativa te agradezco que la compartas Patricia.

    Lorena escribió:
    8 junio, 2012 en 19:40

    Hola, por favor alguien que me comparta como realizar lactosa y perfil de acidos grasos por HPLC detector UV-VIS es mega urgente!!!! veo que `Pache conoce mucho de HPLC se los agradecería mucho.

    lupita escribió:
    13 julio, 2012 en 9:47

    Hola me gustaria saber si conocen algun metodo para determinar acidos organicos como ac. acetico, acido butirico y citrico por hplc- uv. Graciass

    gabi escribió:
    2 octubre, 2012 en 20:05

    Hola! Uso una columna C18 para identificar hidrazonas, pero la presión al mismo flujo (5ml/min) ha incrementado notablemente de 300 psi a 800 psi, he estado lavando con agua 100% y ACN 100% pero este problema no se corrige. Me parece que algo precipitó o está tapando el flujo ¿Podrían ayudarme?

      PACHE escribió:
      9 octubre, 2012 en 16:59

      Doy respuestas hasta por correo y ni así se dignan a decir gracias, me reuso al maltrato jumm jummm, lo peor es q se las respuestas asssshhh…

    PACHE escribió:
    15 octubre, 2012 en 23:30

    Administrador, podrías quitar por favor mis comentarios, sonaba super egolatra jejeje pero ya tuve mi despertar espiritual, asi que te ruego eliminar mis comentarios, seguiré aprendiendo de todos uds xq no lo se todo y siempre abra alguien que sepa mas que yo jejeje, saludos a todos. PD. Ex PACHE

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